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用于研究水生微生物对机械刺激反应的片上微型机器人
文章来源:dj-on-line.com   发布者:学生毕业作品网站  

用于研究水生微生物对机械刺激反应的片上微型机器人

ABABcTFAY)d福井新井,c河野裕之,eIkuko Shihira-Ishikawae和Atsushi Miyawakie

在本文中,我们提出了一种新颖的,磁力驱动的微型机器人,它装有框架结构来测量刺激水生微生物的效果。 描述了基于梁变形的具有位移放大机制的力传感结构的设计和制造。 微机器人由使用微机电系统(MEMS)技术构建的Si-Ni混合结构组成。 具有5毫米宽的力传感器的微型机器人通过永磁体在微流体片中启动,以便它们可以局部地刺激微生物在封闭的微芯片的稳固环境内所需的力。 他们提供厘米级的移动性(无限驱动)和毫牛顿级力(高功率)以及力觉。 最后,我们将开发的微型机器人应用于Pleurosira lavis(P。 laevis)刺激的定量评估,并确定施力与单个细胞响应之间的关系。

介绍

在生物科学中,单细胞的机械刺激已成为调查细胞功能和机械特性的必要条件1–6。特别是,该技术对于了解水生微生物的应用机制具有复要的潜力7,8由于许多水生微生物的力学特性尚未完全了解,所以机械方法对于提高我们对细胞相互作用,细胞生长因子和功能的理解至关复要的机械感受器。 虽然流体力量已被积极地用于刺激微芯片中的细胞以便于实验的方便,但是9,10机械探针是一种更强大的工具,可以将一个力施加来单个细胞的特定部位作为刺激。

在评估机械刺激与微生物反应之间的关系时,应该考虑三个复要的要求:能力

刺激微生物的工具; 测量作为施加的力对细胞的刺激量的能力; 以及保持稳固实验条件的能力,以便可以观察来响应于刺激发生的精确化学反应。 通常,手动或通过在显微镜下使用显微操作器研究微生物。 然而,这些测量方法的吞吐量和灵活性水平非常低,因为操纵者必须处理细长的玻璃工具。 特别是,当使用商用机械手手动施加刺激时,难以感晓施加的力。 另外,由于培养皿用于这些操作,因此将测量系统保持在稳固的条件下而不会受来污染或干扰是非常困难的。 因此,这些系统不能满足研究人员,特别是生物学家的要求。

许多研究集中在旨在操纵和/或测量微生物的微电子机械系统(MEMS)技术上。 孙等人。 开发了基于硅绝缘体(SOI)的两个自由度(DOF)力传感器,该传感器由用于检测电容变化的梳状结构构成11。该传感器评估了卵母细胞的力学性能。 沉等人。 开发了用于测量酵母细胞在环境扫描电子显微镜(ESEM)内的粘附力的纳米探针,该扫描电子显微镜是一种基于框架的力传感器12Cappelleri et al。 提出了一种由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成的用于微型机器人的微纳级力传感器13。该传感器可以通过使用视觉传感器在两个方向上测量力。 然而,为了在狭窄的空间内测量物体,这些传感器必须由显微操作器来操作。 因此,封印很困难

整个测量现场要保持一个稳固的环境,以观察化学反应。 同时,开发了具有纳米定位精度的光学力驱动纳米机器人。  Ikuta等人 开发出一种由光活化树脂制成的6自由度纳米机器人14他们成功地测

量了在流体环境中施加来直径约5mm的酵母细胞上的力。 昂达等人。 开发了一个力量反馈

系统通过使用多束光学镊子15他们的光学方法使片上测量没有污染。 这些方法的缺点是无法生产微生物生产力,这不足以刺激具有坚硬结构的100毫米微生物。

在此基础上,我们提出了一种新颖的片上系统

如图1所示,通过使用磁力驱动的微机器人能够进行力感测以评估在微流体芯片中刺激微生物的效果。通过使用具有力感测结构(即梁结构)的非接触致动微机器人, ,我们可以使用永磁体的强磁力将毫牛顿级的力施加来单个单元,然后估量由梁的变形引起的施加的力。 这样做时,使用完全封闭的生物芯片,因此,我们可以避免污染并在测量过程中保持稳固的实验条件。 这很复要,因为有必要连续观察响应于刺激而在微生物中发生的化学反应。

在这项研究中,我们考虑了100毫米大小的称为Pleurosira laevis(P。 laevis)的中心硅藻,之前已经用机械探针对其进行了研究,以确定

其特殊的行为。 一些植物细胞显示出与刺激响应相似的行为; 然而,P. laevis的单细胞相对简单并且具有坚硬的外壳。 这意味着单个细胞可以通过机械操作轻松处理并从大群体中移除。 因此,挑选P. laevis作为通过机械方法研究微生物生物功能的第一步。

材料和方法

pk10手机投注设计具有力感应结构的微型机器人

放置在微流体芯片中的微机器人由磁性材料制成,并且可以从微流体芯片的外部通过安装在机动平台(即,xy线性平台和旋转电机)上的永磁体来启动,如图1所示。通过使用四个磁体来驱动一个微型机器人,我们可以实现微型机器人在三维自由度(x方向,y方向和h旋转)下的稳固运动16在完全封闭的生物芯片中以毫牛顿的顺序产生的力对细胞进行操纵。 由于使用了封闭的微芯片,我们避免了污染并在测量过程中保持了稳固的条件。 该系统使我们能够不断观察刺激后微生物的化学反应。 此外,我们的方法具有作为缩小尺寸的致动系统和具有一次性芯片结构的优点。 使用传统方法,

我们成功地将三自由度微型机器人的定位精度从几百微米增加来1。1毫米,这是通过使用一种新的安排永磁体的方法和一种

基于振动的方法减少微机器人和基板之间的摩擦16,17当我们想让它在微流控芯片中移动时,我们也成功地使用我们的微型机器人处理了100毫米的细胞。 但是,我们的微型机器人也是如此

传统开发的微型机器人没有传感器来评估施加来细胞上的力18–21

一般来说,任何需要几条电线的力传感器都很难在未受限制的微型机器人的末端实现。 因此,我们设计了一个基于框架梁结构的力传感器,如图1所示。当机器人刺激细胞时,我们可以通过使用相机测量力传感结构的变形来测量施加的力。 尽管基于光束变形的力感测辨别率相对低于其他力测量方法(例如电容变化,压阻效应和应变仪),但简单光束结构和基于视觉的测量的组合提供通过低成本的力传感系统进行片上调查,无需电线。

图2(a)显示了力传感结构的框架模型。 这种结构不是悬臂结构,当微型机器推向微生物时,有必要保持微型机器人直线前进。 另外,放大光束变形的机制被放置在框架内以增加照相机的力感测的灵敏度。 将一个小探针连接来力感测结构的顶端,以推

动细胞上的特定位置。 表1列出了力敏结构的参数。

pk10手机投注这里,放大机构的位移由下式表示

X = ad, (1)

其中a是放大率。 第一,为了获得由力引起的框架变形d,假设框架的一半

图2用于测量静态梁变形的力感测结构。  (a)根据框架的变形程度估算施力。 放大机制有助于放大d的变形。 探针尖端的形状可根据应用要求进行更改。  (b)力量感应结构的细节

图3通过有限元法(FEM)模拟获得的von Mises应力。 当对框架施加2mN的力时,最大应力为350MPa

在梁端处观察(宽度:5mm,厚度:200mm)。 在这个负载下,放大机构没有碰来外框。

r = 500 mm和d = 500 mm,以便在测量过程中观察整个力感测结构。 最后,基于制造的辨别率和力敏结构的耐久性,我们设定h1= 5mm和h2= 40mm。 图3显示了基于设计参数的有限元分析结果。 在此分析中,为了简单起见,我们假定微型机器人结构由各向同性弹性材料制成,尽管Si具有各向异性结构。 这个假设证实5mm宽的力感测结构在Si破裂的应力限制内具有大的弹性变形。 另外,在这种设计中放大机构的放大率a为3.2。

用于实现具有力感测结构的片上微型机器人的制造方法

为了实现具有力感测结构的片上微机器人,需要解决与其制造方法有关的两个问题。 第一,微型机器人与微芯片基板之间存在相当大的摩擦。 这是力感测中的一个关键问题,因为摩擦力的影响将包含在测量的力数据中。 其次,由于力感测结构非常薄。

图4具有力敏微型机器人的微流控芯片的结构。  (a)四层微芯片的三维视图。 上层制成

厚度为5mm的PDMS,机器人层由200mm厚的Si晶片制成,间隔层由10mm厚的负光致抗蚀剂(SU-8)制成,并且底层由100mm - 玻璃杯。  (b)机器人和玻璃层的横截面图。 将驱动力应用于微型机器人

在微芯片外部,将永磁体放置在机动台上,并且将Ni部分部分嵌入机器人(Si)层中。 这也有助于在测力过程中保持机器人与玻璃层之间的空间。 这种垫片作为一种避免摩擦的机制发挥了关键作用。

根据需要,微型机器人不受限制。 如果力感测结构被破坏,另一个机器人可以被分离并用作新的微机器人,如图5(c)所示。 我们设计了宽度为50mm的槽口结构以解释Si的断裂应力(2-3GPa)。22这

方法是新颖的,因为我们创造了一个广泛的活动

具有芯片上的力感测功能的微型机器人。

图6显示了每层的制造过程。 我们开发了一种原始的Si-Ni混合工艺,以避免损坏机器人层。 对于上层,将负性光致抗蚀剂(SU-8 3050,MicroChem)旋涂并暴露在Si晶片上。 通过使用这种模具,我们制造了5毫米厚的PDMS覆盖层(微通道高度:300毫米)。

对于机器人层,第一溅射Cr和Au层

一个200毫米厚的硅晶片底面,有一个(100)晶体取向用于电镀。 然后在电镀期间旋涂Su-8以支撑Cr-Au层。

pk10手机投注接下来,通过光刻法在Si层的顶侧上对正型光刻胶(OFPR 200CP,Tokyo OHKA)进行构图以形成Ni结构。 使用SF6和C4F8的深反应离子蚀刻(DRIE)对Si层进行蚀刻。 然后,通过O2灰化工艺去除Cr层。  Ni结构,

图6具有力传感结构的片上微机器人的制造过程。  (a)通过软光刻制造的上层(PDMS)。  (b)用DRIE和电镀组合制造的机器人层。 通过DRIE蚀刻Si晶片三次,并且通过电镀添加Ni部分。  (c)用光刻法在玻璃层上制造由SU-8制成的间隔层。  (d)通过PDMS和等离子体键合装配的所有层。

意在与来自永磁体的磁力相互作用,通过电流密度为2A的dm22进行电镀。 用化学去除剂(Remover PG,MicroChem)和蚀刻剂洗涤光刻胶(SU-8和OFPR)和Cr-Au层。 然后,用金刚石粉末(直径:0.125mm)研磨Si表面以除去过量的Ni。 之后,通过使用DRIE从背面蚀刻Si层10mm以形成避免摩擦的空间。  OFPR被图案化以在Si层的顶侧上形成微型机器人。 最后,使用DRIE穿透Si层以制造驱动器和力敏结构,随后使用化学去除剂去除SU-8。

通过光刻法在玻璃层上形成10mm厚的间隔层。 最后,用PDMS胶将机器人层附着来间隔物上,并且通过等离子体结合将上层和玻璃层不可逆地组装。

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装配有力感应结构的微型机器人

图7(a)示出了包括六个微机器人结构的制造的机器人层。 图7(b)示出了具有5mm宽的力感测结构的完全制造的单个微机器人。 我们通过使用所描述的制造程序成功地制造了Si-Ni微结构。 考虑来Si的各向异性,我们将切口结构放置在平行于

(100)Si晶片的(110)晶体取向以促进切割表面的断裂和平滑。

图7(c)示出了力感测结构的放大视图。 已经证实,在1%的制造误差内,硅晶片几乎被DRIE垂直蚀刻。

力传感结构的性能

我们评估了制造的力感测结构的辨别率。 为了准确测量实际的力数据,当使用位置精度为2mm的线性平台时,将微机器人推来商用力传感器(LVS-5GA,KYOWA)上,精确度为10mN,如图8(a)。 然后,我们使用带电荷耦合器件(CCD)相机(辨别率:0。9毫米像素21)的显微镜测量变形。

pk10手机投注图8(b)显示了实际力量之间的关系

通过力传感器测量和相机测量的位移X来测量。 这些结果表明在不同条件下发生了一些小的滞后现象。 此外,当施加的力大于3.0-3.5mN时,梁的变形的非线性增加。 基于这些特点,我们只使用推动阶段的位移X,最好将力范畴限制在3 mN左右以正确估量力数据。 图8(c)显示了测量的力与由等式(6)运算的估算的力数据之间的关系。 这个结果证实了测量的和估量的力数据不同。 如右图所示,通过考虑制造误差,我们可以精确地估量力数据

图7制造的微结构的照片。  (a)一个机器人层,在组装过程中有六个微型机器人通过凹口结构连接来该层。 这个微小结构的层可以很容易地用镊子处理。  (b)具有由Si和Ni材料组成的力感测结构的单个微机器人。  (c)由SEM捕捉的力传感器的特写。 摘用DRIE工艺实现了40:1的高纵横比。

pk10手机投注图8制造的力感测结构的评估。  (a)实验概述。 将一个机器人从层上移开并推入商用力传感器以确认其特性。  (b)由放大机构测量的力传感器的变形与在三种不同条件下从商用力传感器获得的测量的力数据之间的关系。  (c)用商用力传感器校准制造的力传感器。 运算得来的力数据是从模型中获得的,并且由于制造发生了误差。 通过使用实际测量的参数来校正估量的力数据来获得估量的力。  (d)在同一机器人层(n = 5)中强制通过不同的力感测结构获得的数据。 机器人以相同的位移和速度推来墙上。 显示时间尺度数据以模拟实际的微生物测量。

图8(c)的侧面。 图8(d)显示了同一机器人层中不同力传感器的力测量标准偏差。 这一结果证实了传感误差的可变性小于10%。 通过在组装微芯片之前仅从制造层校准一个微型机器人,我们可以在测量期间使用其他微型机器人而不用校准。 最后,通过这些实验,我们确认了大约的最小力感测辨别率

80毫牛。 这种类型的力传感器的辨别率是

从相机的辨别率和镜架变形的灵敏度来确定。 但是,正如讨论的那样,一个大的可变形框架导致了很大的滞后和非线性。 因此,通过使用高辨别率相机,我们可以比较容易地提高传感器性能。 我们认为,这种性能可用于评估刚性微生物(如硅藻)的刺激情况,以便在调查的早期阶段提供初步信息。 另外,即使当我们通过推动微型机器人将微型机器推来微通道的壁上时,力传感结构在实验期间也未被破坏

频率3赫兹(最大5毫秒21)。  [多媒体文件可用.3]

应用于微生物评估

pk10手机投注我们将开发的微型机器人应用于实际的微生物。 在淡水中发觉的P。 laevis是以硅藻为中心的硅藻。 这种圆柱形单体电池具有玻璃体

结构(硅质外壳),其厚约1。3mm,长100mm,直径40-80mm,如图9(a)所示。23核位于电池的中心。 单个细胞含有200个盘状,10毫米长的叶绿体。 通常,几个细胞通过粘液连接在一起

如图9(b)所示,从阀表面的突起分泌物质。

这种细胞表现出特殊的行为:当细胞受来刺激时,细胞内的叶绿体在细胞核周围集合。 此外,

这种集合行为被传递给其他连接的单元,如图9(c)所示。 有趣的是,这种行为甚至传递给未连接的细胞。 这种行为的传播回因于未晓活化因子的释放,例如来自受刺激细胞的神经递质,以刺激其他增加生长的细胞。 这种行为被认为与神经元传递信息相似。 从神经学和基于藻类的生物燃料的角度来看,这种行为的调查将有助于理解水生微生物之间的沟通机制。 集合行为是由光电刺激引起的,但这种行为的机制还不完全

图9 P. laevis的外部和功能特点。  (a)单细胞的内部结构,其具有圆柱状硅质表面。  (b)每个细胞通过粘液(粘性流体)与其他细胞连接。 细胞之间没有结构上的联系。  (c)叶绿体结块和传播现象。 所有叶绿体从其初始位置转移来核周围所需的时间为5-15分钟。 完全结块后大约3分钟开始回收,最后所有的叶绿体都复原来初始位置23

24据报道,P.laevis的叶绿体结块行为可以通过机械刺激诱导23,25。研究人员使用微针成功地刺激了单细胞。 然而,这种方法很难用于稳固地刺激单个细胞,因为它是使用手动或大型操纵器完成的。 这些研究不能说明应用力与P. laevis的反应之间的关系。 因此,必须对施加的力量进行定量研究,以阐明P.laevis的叶绿体在机械刺激下的集合行为。 静力检测适用于此目的,因为聚合的响应速度相对较慢(即分钟数量级)。

为了实验,将从河流收集的无菌水引入来微芯片上。 然后,通过从微芯片外部移动磁体将微型机器人从层分离。 此时,磁体的xyh位置由个人运算机根据操作员用操纵杆发出的指示控制的电动平台驱动。 使用1.0mm直径的钕永磁体将磁力施加来玻璃层上的微机器人。 然后,通过在流体环境中移动磁体而实现片上分离,而对力感测结构没有任何损害。 我们确认,由于凹口结构沿着硅晶片的晶体取向排列,所以机器人被清洁地从层中去除而不形成硅切屑。 每个微型机器人的可移动范畴约为230毫米2。 显然,我们可以很容易地增加微型机器人的工作空间,以扩大微型芯片在xyh阶段(400mm2)的可移动范畴内的尺寸。 之后,P. laevis从微芯片的入口被引入,并且细胞的位置由微型机器人控制。 将P.laevis和微小机器人的细胞放置在同一大气中至少30分钟,并将显微镜的光强度最小化以避免任何其他刺激因素(即化学和/或光学效应)。 在单细胞的刺激和观察之后,在下一个实验之前用无菌水洗涤微芯片。

图10(a)显示了实验的概况。 我们确认开发的机器人有足够的力量打破P。 laevis的外壳; 推力被调整以避免损坏电池。 结果,我们成功稳固地刺激了P。 laevis的一个细胞。 然后,如图10(b)所示,估量所施加的力。 如图10(c)中的原始图像所示,刺激后,使用CCD照相机观察叶绿体结块。 从这些图像中,叶绿体的微小机器刺激运动被清楚地证实。 然后,为了评估叶绿体结块的程度,通过从第一图像中减去每个图像(在0分钟处)产生减影图像,并且绘制每个减影图像的像素值的总和,如图10(c )。 通过设定适当的阈值,我们可以确定是否造成集合。 图10(d)显示了11个细胞的实验总结,其中F最大是每次刺激的最大力值,FINT是通过对所施加力的时间序列进行积分来运算的。 这个结果

这表明我们应该至少应用刺激直来受体达来激活的下限。 此外,对于更加具体的评估,瞬时刺激可以有效强调细胞之间刺激反应的差异。

在这个实验中,据我们所晓,有史以来第一次,在这些实验条件下,产生P。laevis集合行为所需的刺激被确定为y2mN。 这一结果表明,开发的机器人系统有可能通过机械刺激来定量评估单一微生物的兴奋剂反应。 由于缺乏用于叶绿体集合的优良评估方法(例如荧光剂),因此图像处理可能是评估集合程度的候选者之一。

在未来的工作中,我们将尝试从拍照的图像中定义和评估组合的具体程度。 同时,我们可能会考虑微型机器人的全自动3-DOF位置控制,以刺激微生物精确测量它并应用各种力模式的机械刺激。 为了准确测量动态下的作用力,我们将考虑梁的动力学并开发一个用于高速研究微型机器人的数值模型。 我们相信,我们特殊的机器人系统及其机械方法应该能够更好地理解微生物与电子和光学方法相结合的未晓生物机制。

目前,微机器人的力感测结构被设计为测量单向力,从而解释了制造过程中涉及的困难。 发觉微型机器人对于研究微生物的刺激是令人满意的。 但是,对于更广泛的应用,最好在微型机器人的末端安装一个多自由度力传感结构。26此外,应使用几种类型的探头来比较推动区域的效果; 在这项研究中,我们摘用了三角形探针(尖端角度:21。0u,尖端曲率半径:0。72mm)

仿照传统的方法,就像细胞反应一样

受尖端几何形状影响23

结论

我们提出了一种不受限制的,磁力驱动的微型机器人,它具有力传感结构,其设计和构造提供了巨大的移动范畴和传感功能。 未受束缚的微型机器人由通过使用光刻和电镀技术的组合构造的Si-Ni混合结构组成。 它很容易通过凹槽结构与层分离,从而避免了摩擦和保护

配备5毫米宽,200毫米高的力传感器。 我们的基础实验的结果证实了制造方法的有效性和力的性能

传感器(最高3。0-3。5 mN)。 最后,通过使用制造的微型机器人,我们成功地评估了在四层微流控芯片中刺激P。laevis的效果。 该实现厘米级移动性和毫牛顿级有力性以及力感测功能的微型机器人可能是研究微生物未晓行为的相当复要的工具。 特别是,我们的平台能够定量评估具有坚硬外部结构的水生藻类的机械刺激。

致谢

pk10手机投注这项工作得来了JST-SENTAN,KAKENHI(23106002,24760204),名古屋大学全球COE计划'微纳米机电一体化教育与研究COE'和九州理工学院青年研究者前沿研究学院的部分支持。

注释和参考

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